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杂交试验中用于降低背景的封闭剂
2005-11-18  









































试剂


用途


denhardt试剂


northern杂交


使用rna探针的杂交


单拷贝序列的southern杂交


将dna固定于尼龙膜上的杂交


denhardt试剂通常配制50×贮存液,过滤后保存于-20℃。可将该贮存液10倍稀释于预杂交液(常为含有0.5%sds和100μg/ml经变性被打断的鲑精dna的6×ssc或6×sspe)中。50×denhardt液中含5g聚蔗糖(ficoll,400型,pharmacia)、5g聚乙烯吡咯烷酮和5g牛血清白蛋白(组分v”sigmal),加水至终体积为500ml。


blotto


grunstein-hogness杂交


benton-davis杂交


除单拷贝序列southern杂交以外的所有southern杂交


斑点印迹


1×blott(牛乳转移技术优化液,bovine lacto transfer technique optimizer),是含5%胶脂奶粉和0.02%叠氮钠的水溶液,应保存于4℃。使用前可用预杂交液稀释25倍。blotto不应与高浓度的sds并用,因为后者会导致牛奶中蛋白质析出。如果杂交背景不合要求,可在杂交液中加入np-40至终浓度为1%。blotto不能用作northern杂交的封闭剂,因为这一封闭剂中可能含有rna酶,其活性之高使人无法接受。


注意:叠氮钠有毒性,取用时需戴手套小心操作。含叠氮钠的溶液应予明确标记。


肝素


southern杂交


原位杂交


肝素(sigma h-7005,从猪中提取的二级产品或相当等级的产品)用4×sspe或4×ssc溶解配制成50mg/ml的浓度,保存于4℃。肝素在含有葡聚糖硫酸酯的杂交液中用作封闭剂的浓度为500μg/ml,在不含葡聚糖硫酸酯的杂交液中的浓度为50μg/ml。


经变性并被打断的鲑精dna


southern和northern杂交


把鲑鱼精子dna(sigma,,盐钠)溶解于水配制成10mg/ml的浓度,必要时于室温磁力搅拌2~4h助溶。把溶液中nacl的浓度调至0.1mol/l,并用酚和酚/氯仿各抽提一次,回收水相。合dna溶液快速通17号皮下注射针头12次,以剪切dna。加入2倍体积用冰预冷的乙醇沉淀dna。离心回收dna并重溶于水,配制成10mg/ml的浓度,测定溶液的od260值并计算出精确的dna浓度,然后煮沸10min,分装成小份保存于-20℃。使用前置沸水浴中加热5min,然后迅速在冰浴中骤冷。预杂交液中应含有100μg/ml经变性并被打断的鲑鱼精子dna

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