一、发酵培养基的分类
培养基(medium)是一种人工配制的、适合微生物生长、繁殖或产生代谢产物用的混合养料。因此,任何培养基都应具备微生物所需要的六大营养要素,且比例应是合适的。培养基一旦配成,必须立即进行灭菌,否则很快引起杂菌丛生,并破坏其固有成分和性质。
目前自然界中只有一部分微生物能够人工培养,主要有病毒、细菌、放线菌、真菌等。
应全面、准确地了解微生物细胞的生命规律,根据微生物的种类和对营养的需求来配制合适的培养基,以提高微生物可培养性,并达到代谢产物高产的目的。
由于各种微生物所需要的营养不同,培养基的种类很多。据估计目前约有数干种不同的培养基,这些培养基可根据所含成分、物理状态及不同的使用目的等而分成若干类型。
1、按照培养基的成分分类
培养基按其所含成分,可分为合成培养基、天然培养基和半合成培养基。
(1)合成培养基也称基本培养基
合成培养基的各种成分完全是已知的各种化学物质。这种培养基的化学成分清楚,组成成分精确,重复性强,但价格较贵,而且微生物在这类培养基中生长较慢,如高氏1号培养基、察氏培养基等。
(2)天然培养基
也称复合培养基由天然物质制成,如蒸熟的马铃薯和普通牛肉汤,前者用于培养霉菌,后者用于培养细菌。这类培养基的化学成分很不恒定,也难以确定,但配制方便,营养丰富,因此常被采用。
(3)半合成培养基
在天然有机物的基础上适当加入已知成分的无机盐类,或者在台成培养基的基础上添加某些天然成分,如培养霉菌用的马铃薯葡萄糖琼脂培养基。这类培养长基能更有效地满足微生物对营养物质的需要。
2、按照培养基的物理状态分类
培养基按其物理状态可分为固态培养基、液态培养基和半固态培养基3类。
(1)固态培养基
在液态培养基中加入凝固剂(如琼脂、明胶、硅胶等)制备成固态培养基。该类培养基常用于微生物分离、鉴定、计数和菌种保存等方面。此外,另一类固志培养基,一般采用天然谷物原料或纤维素类原料,培养基中加水较少,培养基中固形物含量较高。这种固态培养基固、液、气三相并存,气相为连续相,培养基中几乎不含游离水。在自生产中,各类酒曲、米曲、红曲等均是用固态培养基培养的。
(2)液态培养基
将各种培养基物料溶于水中,配成成分均匀的液体或细小颗粒状的培悬浮液。该类培养基可视液相为连续相,微生物能充分接触和利用培养基中的养料,适于作生生理等研究,由于发酵率高,操作方便,也常用于发酵工业。
(3)半固态培养基
是在液态培养基中加入少量凝固剂而呈半固态状态。该类培养基中可用于观察细菌的运动、鉴定菌种和测定噬菌体的效价等方面。
3、按照微生物的种类分类
培养基按微生物的种类可分为细菌培养基、放线菌培养基、酵母菌培养基和霉菌培养基
类。
常用的细菌培养基有营养肉汤和营养琼脂培养基;常用的放线菌培养基有高氏1号培养基;
常用的酵母菌培养基有马铃薯蔗糖培养基和麦芽汁培养基;
常用的霉菌培养基有马铃薯蔗糖培养基、豆芽汁葡萄糖(或蔗糖)琼脂培养基和察氏培养基等。
4、根据培养基在发酵生产中的用途分类
依据培养基在生产中的用途(或作用),也可将生产上应用培养基分为孢子培养基、种子培养基和发酵培养基。
(1)孢子培养基
是供菌种繁殖孢子的一种常用固态培养基,对这种培养基的要求是能够使菌体迅速生长,产生较多优质的孢子,并要求这种培养基不易引起菌种发生变异。对孢子培养基的基本配制要求是:第一,营养不要太丰富(特别是有机氮源),否则不易产生孢子;第二,所用无机盐的浓度要适量,否则会影响孢子量和孢子颜色;第三,要注意孢子培养基的pH和湿度;第四,所选用的各种原材料的质量要稳定。生产中常用的孢于培养基有麸皮培养基,大(小)米培养基,由葡萄糖(或淀粉)、无机盐、蛋白陈等配制的琼脂斜面培养基等。
(2)种子培养基
是供孢子发芽和菌种生长、繁殖用的。营养成分应是易被菌体吸收利用的,同时要比较丰富与完全,其中氮源和维生素的含量要高些,但总浓度以略稀薄为宜以便菌体的生长、繁殖。种子培养基的营养成分都是一些易于吸收的碳源和氮源,如葡萄糖、硫酸铵、尿素、玉米浆、酵母膏和蛋白陈等。种子质量的好坏对发酵的影响很大,为了使培养的种子能够满足发酵的要求,必须将种子培养基和发酵的要求联系起来考虑。最后级种子培养基的成分最好能较接近发酵培养基,这样可使种子进入发酵培养基后能迅速适应、快速生长。
(3)发酵培养基
是供菌种生长、繁殖和合成产物之用。它既要使种子接种后迅速生长,达到一定的菌体浓度,又要使长好的菌体能迅速合成所需产物。因此,发酵培养基的组成除有菌体生长所必需的元素和化合物外,还要有产物所需的特定元素、前体物和促进剂等。但如果生长和生物合成产物需要的总的碳源、氮源、磷源等的浓度太高,或者生长和合成两阶段各需的最适条件不同时,则应考虑采用配制浓度较低、初期用的培养基,然后采用补料流加培养基来满足发酵工艺的要求。
5、按照培养基特殊用途分类
培养基按其特殊用途可分为加富培养基、选择性培养基和鉴别培养基。
(1)加富培养基
是在培养基中加入血液、血清、动植物组织提取液等某些特殊需要的营养成分配制而成的营养更为丰富的培养基。加富培养基一般用于培养对营养要求比较苛刻的微生物。在研究致病微生物时常采用加富培养基。例如,培养某些致病菌常需要在基础培养基中加入血液、血清或动植物的组织提取液等。在含有多种微生物的样品中分离某种微生物时,常需要根据欲分离的微生物的营养嗜好,在基础培养基中添加特定的营养成分,使更加有利于欲分离的目标微生物的生长、繁殖。例如,用液态培养基培养,可使微生物群体中欲要分离的目标微生物随培养时间的延长在数量逐步占据优势,以利于下一步分离;如果是用固态平板培养基培养,可使微生物群体中欲要分离的微生物较早形成菌落而利于分离。
(2)选择性培养基
是根据某一种或某一类微生物的特殊营养要求或对一些物理、化学抗性而设计的培养基。利用这种培养基可以将所需要的微生物从混杂的微生物中分离出来。选择性培养基配制时可根据不同的用途选择特殊的营养成分或添加特定的抑制剂,以达到分离特定微生物的目的。
在实践中有两种方式:一种是正选择(投其所好),另一种是反选择(取其所抗)。
正选择是添加某种特定成分为培养基主要或唯一的营养物,以分离能利用该种营养物的微生物。例如,从混杂的微生物群落中选择性地分离能利用纤维素的微生物时,则把纤维素作为选择培养基的唯一碳源,把混杂的微生物群落样品涂布于此种培养基上,凡能在该培养基上生长、繁殖的微生物即为能利用纤维素的微生物。以此类推,可以分离利用各种各样营养物的微生物。
反选择是在培养基中加入某种或某些微生物生长抑制剂,以抑制所不希望出现的微生物,从而从混杂的微生物群体中分离不被抑制和所需要的目标微生物。例如,在选择培养基中加入青霉素、链霉素以抑制细菌,从而分离霉菌与酵母菌;在基因工程中,也常用加入抗生素的选择培养基来筛选带有抗生素标记基因的基因工程菌株或转化子。
(3)鉴别培养基
用于鉴别不同类型微生物的培养基。例如,在培养基中加入能与目的菌的无色代谢产物发生显色反应的指示剂,从而达到只需用肉眼辨别颜色就能方便地从近似菌落中找出目的菌菌落的培养基。
二、工业培养基的主要原料
1、天然原料及其制品
（1）淀粉类制品
葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖和淀粉等是药物发酵生产中常用的碳源,也是各种微生物最容易利用的碳源。几乎所有的微生物都利用葡萄糖,因此葡萄糖常作为培养基的一种主要成分。但是,在发酵过程中过多的葡萄糖会加速菌体的呼吸,如果此时通风不足,致使培养基中溶解氧不能满足菌体的需要,会使一些酸性中间代谢物(如乳酸、丙酮酸、乙酸等)积累,使培养基pH降低,从而抑制微生物的生长和产物的合成。
淀粉分为玉米淀粉、甘薯淀粉、土豆淀粉和小麦淀粉等多种,应用于不同的药物发酵生产中可以克服葡萄糖代谢过快的弊病,同时淀粉价格比较低廉,来源也较丰富。为节约药物发酵生产所用的大量粮食,降低生产中原料成本,还可采用粗粮或粮食加工过程中的副产物等作为碳源,如玉米粉、土豆粉、葡萄糖结晶母液等。
糖蜜是糖厂生产糖时的结晶母液,是糖厂的副产物。一般糖蜜分为甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜,两者中糖的含量和无机盐的含量都有所不同。药物发酵生产中若以糖蜜为碳源,如果使用恰当,其效果与粮食原料相似。
（2）蛋白质类原料
主要是蛋白胨、鱼粉、酵母浸膏、牛肉浸膏、酵母提取物等;也可用天然的大豆、豆粕、豌豆、麸皮、玉米浆粉、液态玉米浆等。许多食品类的固态发酵产品,发酵原料较为固定,一般不会随意更换。例如,黄酒习惯上用大米为原料,豆酱用大豆为原料。
黄豆粉是发酵生产中常用的有机氮源。根据油脂含量可将其分为3类,全脂黄豆粉(含油脂18%)、低脂黄豆粉(含油脂9%)、脱脂黄豆粉(豆粕,含油脂2%)。豆粕有两种产品:一种是在低温下提取油脂后加工制备的,另一种是在高温下提取油脂后加工制备的。棉籽饼也是应用较广泛的有机氮源。
玉米浆中含有较丰富的玉米可溶性蛋白质,是一种很容易被微生物利用的良好氮源。玉米浆是用亚硫酸溶液浸泡玉米后经过浓缩加工制成的,呈鲜黄到暗褐色、浓稠不透明的絮状悬浮物,约含50%干物质。由于玉米的来源不同,加工条件各异,玉米浆的成分常有较大波动,在使用时应注意适当调配。
蛋白胨、酵母粉、鱼粉等也是常用的有机碳源。蛋白胨多由动物组织和植物经酸或酶水解制备的。酵母粉或酵母浸汁含有蛋白质、氨基酸、维生素等,主要来自啤酒酵母和面包酵母。商品鱼粉含有60%左右的粗蛋白, 12%左右的油脂, 4%~5%的氯化钠。
（3）纤维素类原料:如谷糠、各种秸秆、稻草、芒秆、木屑,可用于饲料、食用菌或燃料乙醇的生产,一般用于固态发酵,作为其他发酵物料中的填充物。
（4）食品和发酵工业副产物:这些副产物含有未完全利用的蛋白质、淀粉和纤维素等,如啤酒糟、白酒糟、黄酒糟、酱油糟、柠檬酸等副产物。通过固态发酵,提高其营养价值或改善其适口性,主要用作饲料。
（5）废弃物:如城市餐厨余物、废旧报纸、造纸厂纤维废渣、禽畜类排泄物、沼气发酵残渣等,含有大量的有机物,对环境造成很大的危害,也可通过固态发酵使之无害化或资源化。
2、化学原料
氮源可采用硫酸铵、氨水、尿素、硝酸铵等;无机盐可用氯化钠、硫酸镁、硫酸锰等。化学原料纯度高,成分较明确。磷酸氢二铵则同时供应磷元素和氮元素。
三、原料的预处理的基本方法
发酵生产原料的形态多种多样,有液体状、膏状、结晶状,天然的固态原料,有颗粒状、块状、粉末状等。为了将这些原料制备成适合于微生物发酵的培养基,必须对有的原料进行适当的预处理。这些预处理方法主要是物理方法, 目的是使天然原料在外观上或内在皮分上变得整齐划一或均匀一致,便于后续的培养基灭菌操作,或者便于微生物的利用。
许多传统固态发酵,原料一般无需复杂的预处理,固体原料预处理的主要单元操作包括筛分、除杂、精白、清洗、浸泡、粉碎、制坯、切块、润湿等。不同的固态发酵产品有不同的原料预处理方法。以下主要叙述颗粒或粉状物料的预处理。
1、除杂
原料中含有灰尘杂物等,可用振动筛之类的设备对原料大米进行除杂,机械化新工艺中可利用输米时的旋风分离器进行除尘。
2、精白
对于黄酒或清酒酿造原料用米,因为糙米的外层(糊粉层)及胚部分含有丰富的蛋白质、脂肪、粗纤维和灰分。大量的蛋白质在黄酒发酵酿造时,会生成大量的氨基酸,脂肪在发酵过程中会出现氧化,产生酸臭和口味变苦的现象。可采用精米机对米进行精白处理,精米机采用金刚辊磨擦去外皮糊粉层。
用精米率表示米的精白程度。精米率是精白后的白米占精白前糙米的质量比例。日本清酒生产中大米的精米率为50%~70%,故其口感清爽。在我国黄酒的精米率约为90%。
3、破碎和粉碎
固体的破碎和粉碎是将大块物料借助机械外力粉碎成适宜程度的碎块或细粉的操作过程。粉碎目的在于减少粒径、增大比表面积。物料通过粉碎有利于提高难溶性成分的溶出度和生物利用度;并节省蒸煮时的蒸汽消耗,提高原料的利用率。
原料越细,原料的利用率越高,对于液态发酵原料处理而言,原料越细,越有利于后续的液化和糖化。但对于固态发酵物料,并不需要粉碎得很细,原料过细,颗粒间空隙小,有可能造成孔隙率降低,减少了基质内气体的体积和气体交换,影响氧气在基质内的传递,造成局部缺氧。基质含水量过大,也会降低基质的多孔性,易造成局部缺氧,厌氧菌滋生。基质水分过少,物料吸水不足,基质膨胀程度低,物料发干,微生物缺水,生长受到抑制。
根据粉碎的程度,主要分为轧碎、破碎和粉碎。轧碎,如在黄酒生产中所用的麦曲破碎时,采用轧麦机,将麦子轧成5或6瓣。破碎,是将大块物料用机械方法将其变为小主物料,其制品统称为碎块,直径界定尺寸在5mm以下;还有一种经破碎后的直径界定在1.5~5mm的称为“碎粒". 图粉碎则是粉碎成粒径不同的粉末状。粉末的直径界定在0.3~1. 5mm,其制品称为“粉末”。"微粉碎”则是将物料粉碎成直径界定在0.05~0.3mmm的粉末,称为“微粒”。还有称之为“亚微粒子”的直径为0.001~0.05mm。此外,还有超微粉碎和极微粉碎,这在固态发酵原料处理上用得很少。
用粉碎度表示物料粉碎的程度。原料粉碎可分为干法粉碎与湿法粉碎。干法粉碎:物料处于干燥状态下进行粉碎的方法。而湿法粉碎是在物料中加入适量的水或其他液体进行研磨的方法,可减少粉碎操作时的粉尘飞扬,减轻粉尘对人体的危害。
