超氧化物岐化酶(SOD)的应用方案

超氧化物岐化酶(SOD)的应用方案(三氮蓝四唑NBT法测定)

引言：

SOD是含金属辅基的酶。高等植物含有两种类型的SOD:Mn-SOD和Cu.Zn-SOD，它们都催化下列反应:由于超氧自由基(02)为不稳定自由基，寿命极短，测定SOD活性一般为间接方法。并利用各种呈色反应来测定SOD的活力。核黄素在有氧条件下能产生超氧自由基负离子02-..-，当加入NBT后，在光照条件下，与超氧自由基反应生成单甲躜(黄色)，继而还原生成二甲躜，它是一种蓝色物质，在560nm波长下有最大吸收。当加入SOD时，可以使超氧自由基与H结合生成H2O2和02，从而抑制了NBT光还原的进行，使蓝色二甲攒生成速度减慢。通过在反应液中加入不同量的SOD酶液，光照--定时间后测定560nm波长下各液光密度值，抑制NBT光还原相对百分率与酶活性在一定范围内呈正比。反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低。

仪器及试剂

美析UL-1000超微量紫外可见分光光度计

离心机

0.05mol/L 磷酸缓冲液(PBS，pH7.8):

A母液: 0.2mol/L磷酸氢二钠溶液:取Na2HPO4 12H20(分子量358.14)71.7g; B 母液: 0.2mol/L 磷酸二氢钠溶液:取NaH2PO4 12H2O (分子量156.01) 31.2g。分 别用蒸馏水定容到1000ml。

0.05mol/L PBS ( pH7.8)的配制:分别取A母液(Na2HPO4) 228.75ml,

B母液(NaH2PO4) 21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。

14.5mM甲硫氨酸溶液:称取1.0818g Met用磷酸缓冲液(pH7.8)定容至500ml。

3mM EDTA-Na2溶液:称取0.1117g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至100ml。

60μM核黄素溶液:称取0.0023g核黄素用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。

2.25mM氮蓝四唑(NBT)溶液:称取0.092g NBT用PBS定容至50ml,避光保存。