设计空白对照
（1）检验过程中需要做空白对照，用来判断培养基、稀释液、平皿或吸管是否存在污染，完美的空白试验平板上应该无细菌生长。
实验环境要求
（2）定期检测空气洁净度，判断实验环境是否符合标准要求。
灭菌处理
（3）细菌检测过程中所用到的一切用具和培养基都需经过灭菌程序。
样品消毒
（1）任何样品在打开包装前，都要在取样开口处的周围表面进行消毒。
（2）采样时对于易堵塞吸管的样品（如糕点面包辣条等），可以放置一块无菌纱布在放样液的容器瓶口下方，作过滤用。
稀释度选择
样品的稀释是菌落计数的关键步骤之一。对于固体或半固体样品，通常需要将样品均质化后进行系列稀释。建议使用无菌的生理盐水或磷酸盐缓冲液进行稀释，并确保每次稀释后的样品均匀混合。对于液体样品，可以直接进行稀释，但同样需要注意混合均匀性。选择合适的稀释度非常重要，一般建议选择2-3个适宜的稀释度进行检测，以确保最终的菌落数在可计数范围内（30-300 CFU）。
参考值
参考值可能是实验室经验累积的估算数，也可能是样品本身标注的活菌数值。对于有经验的操作者而言，即使没有明确的参考值，也能凭借经验准确进行稀释操作。然而，对于新手来说，缺乏参考值的情况下可能会感到迷茫。在进行菌落计数时，首先尽可能获取参考值。根据参考值，可以选择适当的稀释倍数，然后将适量的样品与适量的培养基混合，并进行均匀涂布。如此一来，可以保证每个培养皿中的菌落数量在合适的范围内，从而得到准确可靠的结果。
扩大计数范围
选择合适的稀释倍数和扩大计数范围是至关重要的。一种常见的策略是根据经验或参考值将样品稀释到一定倍数，然后在不同梯度上进行涂布。例如，稀释到10^-8的样品可以选择不同梯度的平板进行涂布，比如10^-8、10^-7、10^-6各三个平板。同时，也可以选择其他梯度如10^-9、10^-5、10^-4各一个平板，并留出一个对照平板。不同的食品其「菌落总数」的检出限量也不一致，通常糕点类样品中细菌量偏低，稀释度应选择较小的，稀释度可选1:10 。
其次，培养基的选择和准备也是影响菌落计数结果的重要因素。平板计数琼脂（PCA）是常用的培养基之一，其灭菌条件为121℃、15分钟。在倾注培养基时，应确保培养基温度适宜（约46℃），以避免高温对微生物的杀伤作用。此外，对于一些特殊样品，可以在培养基中加入适量的2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC），以便在培养后将菌落染色，方便计数。
平板倒置培养，可以减少培养基中水分的蒸发影响细菌生长，又可以防止凝结在皿盖上的水蒸气流到培养基表面导致染菌出现菌落蔓延及难以计数。菌落蔓延主要有两个原因，一是操作不当；二是样品中含有变形杆菌等运动性强的细菌。
操作中需要注意3个关键点：
（1）倾注培养基时摇晃平皿使其混合均匀，减少菌块；
（2）样品稀释后，尽快倾注平板。从稀释到倾注结束时间控制在30分钟之内，避免样液干涸造成菌落成团；平板凝固后马上倒置；
（3）若样品中含有变形杆菌，则可以覆盖一层培养基（约4mL）。
在完成培养后应立即进行计数，通常选取30-300CFU菌落数、无蔓延菌落生长的平板作为计数，但实际操作中会出现各种异常现象。
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现象
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计数方式
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无任何明显界限的链状菌落
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作为一个菌落
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有几条不同来源的链
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每条链均应按一个菌落计算
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片状菌落不到平板一半，而另一半又分布均匀
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半个平板的菌落数乘2代表整块平板的菌落数
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