关于使用微生物方法测定婴幼儿食品中维生素B12的一点心得

Apple是个小苹果

关于使用微生物方法测定婴幼儿食品中维生素B12的一点心得

哈哈，好久不见，我又回来了，楼主前两天去外地出差了，今天终于回来了，趁着有时间，赶紧再写一篇莱士曼氏乳酸杆菌跟维生素B12检测有关的文章，供大家参考，与大家讨论~
维生素B12的测定
维生素B12的微生物测定方法一般都是用GB5413.14-2010这个标准，测试对象一般是婴幼儿食品和乳品。

1、标准溶液的制备：标准品一定要准确称量，而且计算需要量的时候要考虑标准品含水量之类的因素，不要算错了，标准溶液是标杆，它如果出现错误，后面的每一步就都没有意义了，配置的时候记得用25%的乙醇溶液，建议除了工作液现用现配外，储备液和中间液先都一起配好，贴好试剂标签，放4℃冰箱保存，还有要注意，配置标准溶液时不要称样，称样的时候不要配置标准溶液，以防交叉污染。

2、样品的制备以样液的提取：按照标准里面的配方配制维生素B12的提取液，121℃10min的提取过程不可省略，如果样品是乳品类直接就按照标准后续要求进行过滤和定容，如果样品是婴幼儿面条或米粉，在样品提取后冷却到室温时，可以根据样品的淀粉含量加入一点淀粉酶，这个酶的量没有固定值，标准上也没有明确规定，我们在实际操作中一般就加指甲盖大小的量就够了，然后放36℃培养箱过夜酶解，第二天早上再进行过滤和定容（因为加的酶的量比较少，所以就忽略了酶对结果的影响），这样过滤起来比较省力（我们都是使用0.45um和0.22um的滤膜进行过滤的，如果淀粉类药品不经过酶解，过滤的时候会让你生无可恋），过滤后样液也比较清澈，同样的，这里也要注意区分样品的基质，油性的样品基本不适用微生物方法来测B12的含量。

3、培养基的制备：维生素B12测定用培养基最好买进口的（推荐BD家的，不是我不支持国货，国产培养基不知道是营养物质不够还是怎么的，就是测试效果不好，为了获得不错的实验结果还是选择BD的吧），然后就是煮沸的时候多让它沸腾几次，让培养基完全溶解，冷却到手能拿住烧杯的温度，过滤，过滤，过滤，重要的事情说三遍，一定要过滤煮沸过的培养基，去除杂质，不然有可能整条标线都会废掉，然后让过滤过的培养基在冰箱中过夜，第二天再用。

4、菌种的制备：莱士曼氏乳酸杆菌活性不是很好，所以我们都戏称它为“来得慢菌”，虽然不需要像标准中叙述的先划平板再接肉汤那么麻烦，直接肉汤培养就好，但是用肉汤培养也是有讲究的，首先莱士曼需要用甘油冻存，不要直接做磁珠冻存，先做一管磁珠，-70℃冻干保存，制作甘油冻干管时先挑一个磁珠接入乳酸杆菌肉汤，36℃培养24小时，然后用这个肉汤来做甘油冻存管，200uL菌液+200uL60%甘油一起加入一根1.5mL的灭菌离心管，然后-70℃冻存，用之前先解冻意志甘油冻干管，然后全部吸入一支新的乳酸杆菌肉汤，36℃培养20h，然后从这支乳酸杆菌肉汤中吸取5滴以内的肉汤加入一支新的乳酸杆菌肉汤，培养6h（举例说明，第一天下午4点左右先解冻甘油冻干管加入一支乳酸杆菌肉汤，36℃培养到第二天早上9点左右，从这支肉汤中再吸取5滴以内肉汤加入一支新的乳酸杆菌肉汤，36℃培养到下午2~3点左右再进行后续离心和清洗）。

5、标准曲线的制作：这个就完全按照标准来做就好，灭菌后要迅速冷却试管，可以放在冰水里面冷却，不然培养基颜色会变深，影响实验结果。一般标准曲线和样品测试管我都会做两平行，保证结果准确性和重现性，我觉得双平行是在实验准确性和可行性之间一个比较好的平衡点。加水、培养基、标液和样液的时候推荐使用吸管法吸取，最好用洗耳球吸取，其次是用电动枪吸管法，当然这两种方法非常考验臂力，基本做完实验两条胳膊已经麻木了，但是这样操作误差比较小，最后的实验结果会比较准确，如果你实在不愿意用吸管，那就用移液枪吧，但是一定要注意吸取液体以后要把粘在吸管外的液体挂掉再加入试管，这一步中多一滴或者少一滴对后续会有非常大的影响，所以一定要小心哦。

6、接菌及培养：培养过的肉汤，要离心，再用0.9%的生理盐水清洗，去除培养基的颜色对实验的影响，一定要洗够3遍，不能偷懒，然后吸取600~800uL菌液加入一支新的0.9%无菌生理盐水中，这支生理盐水就是最终要使用的菌悬液啦，注意这里是根据我们实验室的莱士曼的活性来制订的菌种活化方法以及接种量，不一定全部适用，仅供大家参考哦。

7、测定：这个也没啥好说的，就按照标准上的要求操作就好，一般来说双平行读出的数据差别不会很大，如果两条标线读数差别很大的话就要反思一下前面的步骤哪里出现了问题，下次要注意哦

8、试管、容量瓶、烧杯等容器的清洁：实验完成后，所用到的试管、容量瓶、烧杯等容器一定要清洗干净，做到无残留，不然下一次实验就会让你生无可恋，一般我会配制硫酸重铬酸钾溶液来浸泡实验用到的容器，先清洗，再浸泡24小时后再用蒸馏水清洗，最后放到250℃烘箱烘干4小时以上，所以小伙伴们要计算好实验时间和容器的使用量，合理安排资源哦。当然，硫酸重铬酸钾溶液配制起来比较危险，是用浓硫酸配的，配制时一定要做好防护措施，注意安全，而且硫酸重铬酸钾溶液对环境也不是很友好，大家可以试着去找一些玻璃器皿的清洁剂，如果有用的好的品牌的话也欢迎推荐给我哟（我是试用过几个牌子的清洁剂，但效果都不是很理想，所以就一直还在用传统的泡酸法）~

最后的最后，再划一遍重点：

1、配标液的时候注意计算称取的量，一般都是很微少的量，用分析天平称量的时候要准确，最好关门关窗，不要有过多的走动，注意不要交叉污染；

2、注意区分样品的基质，建议拒绝油性基质的样品，注意看方法检出限，如果样品里维生素B12的含量低于标准检出限，建议退单或者推荐使用非微生物方法进行检测，如果一定要用微生物方法测试，注意规避自己的风险，出具报告时需注明“样品中维生素B12含量低于标准检出限，结果仅供参考”等意义相近的术语，减少投诉风险；

3、培养基注意一定要过滤，样液制作过程去也要过滤，过滤是实验成功的一个很重要的步骤，一定不能偷懒哦；

4、菌种培养注意操作过程，需要转种2次，保持菌的最佳活性，才能有好结果；

5、实验用的玻璃器皿一定要清洗干净，无残留；

6、稀释倍数、计算公式要搞清楚，不要出现计算或换算方面的错误。

关于维生素B12的测定目前我就想到这么多了，其实有很多内容都是在炒冷饭，但是都是维生素测定过程中需要注意的，所以就又啰嗦了一遍，希望能帮到大家，如果有遗漏没有提到的地方欢迎大家查漏补缺，或者大家还有什么疑问可以在评论区提问，有时间的话都会回复大家的啦，OK，又完结了一篇。

lttwish

关于菌种方面值得借鉴，我们按照您的方法尝试一下。莱氏曼士乳酸杆菌确实比较难以保存。

Apple是个小苹果

是的，莱士曼比较难保存而且活性时好时坏，用甘油冻存是不错的选择，甘油对它有保护作用~

艾丫丫

请教您，维生素B12标准物质国标中要求是纯度≥99%，我这边公司采购在坛墨准备买纯度97.5%的，请问下这个影响大么？

Apple是个小苹果

艾丫丫 发表于 2018-3-26 14:29
请教您，维生素B12标准物质国标中要求是纯度≥99%，我这边公司采购在坛墨准备买纯度97.5%的，请问下这个影 ...

这个你在计算具体称取量的时候按照纯度计算一下就好，比如说需要称量的质量为0.1mg，如果纯度是99%的话，实际需要称取0.1/0.99的量，如果纯度是97.5%，实际需要称量0.1/0.975的量

艾丫丫

Apple是个小苹果 发表于 2018-3-30 14:10
这个你在计算具体称取量的时候按照纯度计算一下就好，比如说需要称量的质量为0.1mg，如果纯度是99%的话， ...

谢谢您，因为标准里边明确了维生素B12标准品纯度≥99%，所以我考虑纯度不够的会不会对实验结果有影响。

Apple是个小苹果

艾丫丫 发表于 2018-3-30 15:32
谢谢您，因为标准里边明确了维生素B12标准品纯度≥99%，所以我考虑纯度不够的会不会对实验结果有影响。

因为不同厂家生产的标准品会有差异，所以我们只要保证最终配置的储存液的浓度达到标准要求就可以啦

艾丫丫

Apple是个小苹果 发表于 2018-4-2 13:23
因为不同厂家生产的标准品会有差异，所以我们只要保证最终配置的储存液的浓度达到标准要求就可以啦

好的，谢谢您！

18781331345

请问，食品里面的维生素B可以采用药品里面的检测方法，高效液相色谱来检测吗？是不是检测不准？所以才用的微生物检测法

mxytwins

多谢楼主的分享，正好要学习这一块。

grgtestzp

谢谢分享，学习了

紫云@cris

你好，关于B12，调PH值怎么调